後陽成天皇はかねてから豊臣秀吉の意向で立てられた儲君・第1皇子良仁親王（覚深法親王）を廃して、自らの手で次期天皇を決める事を望んでいた。だが、関ヶ原の合戦によって新たに権力の座を手に入れた徳川家康もまた皇位継承に介入し、良仁親王の出家（皇位継承からの排除）は認めるものの、これに替わる次期天皇として嫡出男子であった第3皇子の政仁親王の擁立を求めた。最終的に後陽成天皇はこれを受け入れたものの、結果的には自己の希望に反して家康の意向によって立てられた政仁親王に対しても良仁親王と同様に冷淡な態度を取るようになった。
慶長16年3月27日に後陽成天皇から譲位され践祚。4月12日に即位の礼を行う。だが、父・後陽成上皇との不仲はその後も続き、南光坊天海や板倉勝重の仲裁にも関わらず不仲は後陽成の死まで続いた。
江戸幕府は朝廷の行動の統制を目的として慶長18年6月16日（1613年8月2日）には、「公家衆法度」「勅許紫衣（しえ）法度」を制定し、次いで慶長20年7月17日（1615年9月9日）には「禁中並公家諸法度」を公布した。以後、朝廷の行動全般が京都所司代を通じて幕府の管理下に置かれた上に、その運営も摂政・関白が朝議を主宰し、その決定を武家伝奏を通じて幕府の承諾を得る事によって初めて施行できる体制へと変化を余儀なくされた。これによって摂家以外の公卿や上皇は朝廷の政策決定過程から排除され、幕府の方針に忠実な朝廷の運営が行われる事を目指していた。
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寵愛の女官四辻与津子との間に皇子・皇女が居た事が発覚すると、徳川秀忠は娘の和子の入内を破談にすると恫喝するが、近臣を処罰するなどの詫びを行い、元和6年（1620年）に徳川和子が女御として入内する。寛永4年（1627年）に紫衣事件、徳川家光の乳母である福（春日局）が無位無官で朝廷に参内するなど天皇の権威を失墜させる江戸幕府のおこないに耐えかねた天皇は同6年11月8日、二女の興子内親王（のちの明正天皇）に譲位した。一説には病気の天皇が治療のために灸を据えようとしたところ、「玉体に火傷の痕をつけるなどとんでもない」と廷臣が反対したために退位して治療を受けたと言われているが、天皇が灸治を受けた前例（高倉・後宇多両天皇）もあり、譲位のための口実であるとされている。
以後、霊元天皇までの4代の天皇の後見人として院政を行う。その後も上皇（後に法皇）と幕府との確執が続く。また、東福門院（徳川和子）に対する配慮から後光明・後西・霊元の3天皇の生母（壬生院園光子・逢春門院櫛笥隆子・新広義門院園国子）に対する女院号贈呈が死の間際（壬生院の場合は後光明天皇崩御直後）に行われ、その父親（園基任・櫛笥隆致・園基音）への贈位贈官も極秘に行われるなど、幕府の朝廷に対する公然・非公然の圧力が続いたとも言われている。その一方で、本来は禁中外の存在である「院政の否定」を対朝廷の基本政策としてきた幕府が後水尾上皇（法皇）の院政を認めざるを得なかった背景には東福門院が夫の政治方針に理解を示し、その院政を擁護したからでもある。
延宝8年に85歳の長寿で崩御し、泉涌寺内の月輪陵（つきのわのみささぎ）に葬られた。尚、京都市上京区の相国寺境内には後水尾天皇の毛髪や歯を納めた、後水尾天皇髪歯塚が現存する。1985年7月12日までは歴代最長寿の天皇でもあった。なお、後水尾天皇の記録を抜いた昭和天皇は、「後水尾天皇の時は平均寿命が短く、後水尾天皇の方が立派な記録です」とコメントしている。
日光東照宮には陽明門をはじめ各所に後水尾天皇の御親筆とされる額が掲げられており、後に板垣退助が強硬に日光東照宮の焼き討ちを要求する薩摩藩を説得する理由の1つとして挙げたとされる。